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本试剂盒基于Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光(Ex=490nm,Em=515nm)。因其在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein,AM细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶(PI)等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(Ex=535nm,Em=617nm)，因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发，仅可观察到死细胞。

• 工作液的配制
  
  • 1×Assay Buffer的配制
    从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水(dH2O)做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。
    
  • 1×染色工作液的配制
    
    • 先将低温保存的Calcein-AM溶液(2mM)和PI溶液(1.5mM)回到室温20～30min。
      注意：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。
      
    • 取5μL Calcein-AM溶液(2mM)和15μL PI溶液(1.5mM)加入5mL 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2μM，PI的工作液浓度为4.5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
      注意：由于Calcein-AM的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
• 染色步骤
  
  • 收集细胞：
    
    • 贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞(1000rpm，3min)。
      
    • 悬浮细胞，直接离心(1000rpm，3min)收集细胞。
  • 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2～3次，以充分去除残留的酯酶活性。
    
  • 用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1×10⁵～1×10⁶细胞/mL。
    
  • 取100μL染色工作液加入200μL细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。
    注意：如果需要，可延长孵育时间至30min。
    
  • 荧光显微镜下使用490±10nm激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
    注意：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。
    
    • 用0.1%皂素或者0.1～0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；
      
    • 用0.1～10μM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
      
    • 用0.1～10μM的Calcein-AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。